.: ORİJİNAL ARAŞTIRMA
The Investigation of Effects of Medicinal Leech Saliva Extract on the Breast Fibroblast Cell Line In Vitro: An Experimental Study
Tıbbi Sülük Tükürük Ekstraktının Meme Fibroblast Hücre Hattı Üzerine Etkilerinin İn Vitro Araştırılması: Deneysel Bir Çalışma
J Tradit Complem Med. 2023;6(2):142-51
doi: 10.5336/jtracom.2022-92875
Makale Dili: EN
Tam Metin
ABSTRACT
Objective: Medicinal leeches benefit by delivering various bioactive substances from their saliva during sucking. It was aimed to investigate the effects of leech saliva extract (LSE) on breast fibroblast cell line (Hs 578Bst) and HUVEC (CRL-1730) line in vitro. Material and Methods: Leech saliva was obtained from medicinal leeches of the Hirudo verbana species. The LSE was obtained from the Hirudo verbana. LSE dose amounts (400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL and 50 µg/mL) were adjusted for protein concentration. In cell culture; cell viability, apoptosis, cell migration and gene expressions responsible for these effects were evaluated. The effect of LSE on the cell viability was evaluated with MTT assay. The Scratching Test was used to evaluate the effects of LSE on the cell migration. The effect of LSE on mRNA expression levels of fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor (EGF) was determined with polymerase chain reaction. The effect of LSE on apoptosis was investigated with flow cytometry. Results: The doses of LSE (400-50 µg/mL) significantly increased the cell viability compared with the control group for 24 h and 48 h (p<0.05). In the scratching test, it was observed that the 50 µg/mL dose induced the cell migration and covered all areas with cells at 24 h. It was observed that 200 µg/mL LSE up-regulated the mRNA expression of FGF, VEGF and EGF compared with the control and other groups (p<0.001). All doses of LSE shows no apoptotic or necrotic effects in the cell lines. Conclusion: In this study, it was found that the LSE applied at different doses had significant effects on the cell viability, cell migration and gene expression responsible for these effects in the breast fibroblast cell line.
Keywords: Leech saliva extract; cell viability; angiogenesis; apoptosis; proliferation
Objective: Medicinal leeches benefit by delivering various bioactive substances from their saliva during sucking. It was aimed to investigate the effects of leech saliva extract (LSE) on breast fibroblast cell line (Hs 578Bst) and HUVEC (CRL-1730) line in vitro. Material and Methods: Leech saliva was obtained from medicinal leeches of the Hirudo verbana species. The LSE was obtained from the Hirudo verbana. LSE dose amounts (400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL and 50 µg/mL) were adjusted for protein concentration. In cell culture; cell viability, apoptosis, cell migration and gene expressions responsible for these effects were evaluated. The effect of LSE on the cell viability was evaluated with MTT assay. The Scratching Test was used to evaluate the effects of LSE on the cell migration. The effect of LSE on mRNA expression levels of fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor (EGF) was determined with polymerase chain reaction. The effect of LSE on apoptosis was investigated with flow cytometry. Results: The doses of LSE (400-50 µg/mL) significantly increased the cell viability compared with the control group for 24 h and 48 h (p<0.05). In the scratching test, it was observed that the 50 µg/mL dose induced the cell migration and covered all areas with cells at 24 h. It was observed that 200 µg/mL LSE up-regulated the mRNA expression of FGF, VEGF and EGF compared with the control and other groups (p<0.001). All doses of LSE shows no apoptotic or necrotic effects in the cell lines. Conclusion: In this study, it was found that the LSE applied at different doses had significant effects on the cell viability, cell migration and gene expression responsible for these effects in the breast fibroblast cell line.
Keywords: Leech saliva extract; cell viability; angiogenesis; apoptosis; proliferation
ÖZET
Amaç: Tıbbi sülükler kan emme sırasında tükürüklerinden konakçının kan dolaşımına çeşitli biyoaktif maddeler salarak fayda sağlarlar. Çalışmamızda tıbbi sülük salgı ekstraktının [leech saliva extract (LSE)] meme fibroblast hücre hattı (Hs 578Bst) ve HUVEC (CRL-1730) hattı üzerindeki etkilerinin in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Sülük salgısı, Hirudo verbana türü tıbbi sülüklerinden elde edildi. Bu sülük salgısının toplam protein konsantrasyonu belirlendi ve doz miktarları (400 ug/mL, 200 ug/mL, 100 ug/mL ve 50 ug/mL) seri dilüsyon ile ayarlandı. Hücre kültüründe hücre canlılığı, apoptoz, hücre göçü ve bu etkilerden sorumlu gen ekspresyonları değerlendirildi. LSE'nin hücre canlılığı üzerindeki etkisi MTT analiziyle değerlendirildi. LSE'nin hücre göçü üzerindeki etkisini değerlendirmek için Scratch Testi kullanıldı. LSE'nin fibroblast büyüme faktörü [fibroblast growth factor (FGF)], vasküler endotelyal büyüme faktörü [vascular endothelial growth factor (VEGF)] ve epidermal büyüme faktörünün [epidermal growth factor (EGF)] mRNA ekspresyonları üzerine etkisi polimeraz zincir reaksiyonu ile analiz edildi. LSE'nin apoptoz üzerine etkisi flow sitometri ile araştırıldı. Bulgular: LSE'nin tüm dozları (400-50 µg/mL) kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hem 24 saat hem de 48 saatte hücre canlılığını artırdığı gözlemlendi (p<0,05). Scratch testinde, 50 µg/mL dozunun hücre göçünü indüklediği ve 24 saatte tüm alanları hücrelerle kapladığı gözlemlendi. LSE'nin 200 ug/mL dozunun kontrol ve diğer gruplarla karşılaştırıldığında FGF, VEGF ve EGF mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığı gözlemlendi (p<0,001). LSE'nin hücre hatlarında nekrotik veya apoptotik etkisi olmadığı tespit edildi. Sonuç: Bu çalışmada, farklı dozlarda uygulanan LSE'nin meme fibroblast hücre hattında hücre canlılığı, hücre göçü ve bu etkilerden olası sorumlu gen ekspresyonları üzerinde önemli etkileri olduğu bulundu.
Anahtar Kelimeler: Sülük salgı ekstraktı; hücre canlılığı; anjiyogenez; apopitoz; proliferasyon
Amaç: Tıbbi sülükler kan emme sırasında tükürüklerinden konakçının kan dolaşımına çeşitli biyoaktif maddeler salarak fayda sağlarlar. Çalışmamızda tıbbi sülük salgı ekstraktının [leech saliva extract (LSE)] meme fibroblast hücre hattı (Hs 578Bst) ve HUVEC (CRL-1730) hattı üzerindeki etkilerinin in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Sülük salgısı, Hirudo verbana türü tıbbi sülüklerinden elde edildi. Bu sülük salgısının toplam protein konsantrasyonu belirlendi ve doz miktarları (400 ug/mL, 200 ug/mL, 100 ug/mL ve 50 ug/mL) seri dilüsyon ile ayarlandı. Hücre kültüründe hücre canlılığı, apoptoz, hücre göçü ve bu etkilerden sorumlu gen ekspresyonları değerlendirildi. LSE'nin hücre canlılığı üzerindeki etkisi MTT analiziyle değerlendirildi. LSE'nin hücre göçü üzerindeki etkisini değerlendirmek için Scratch Testi kullanıldı. LSE'nin fibroblast büyüme faktörü [fibroblast growth factor (FGF)], vasküler endotelyal büyüme faktörü [vascular endothelial growth factor (VEGF)] ve epidermal büyüme faktörünün [epidermal growth factor (EGF)] mRNA ekspresyonları üzerine etkisi polimeraz zincir reaksiyonu ile analiz edildi. LSE'nin apoptoz üzerine etkisi flow sitometri ile araştırıldı. Bulgular: LSE'nin tüm dozları (400-50 µg/mL) kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hem 24 saat hem de 48 saatte hücre canlılığını artırdığı gözlemlendi (p<0,05). Scratch testinde, 50 µg/mL dozunun hücre göçünü indüklediği ve 24 saatte tüm alanları hücrelerle kapladığı gözlemlendi. LSE'nin 200 ug/mL dozunun kontrol ve diğer gruplarla karşılaştırıldığında FGF, VEGF ve EGF mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığı gözlemlendi (p<0,001). LSE'nin hücre hatlarında nekrotik veya apoptotik etkisi olmadığı tespit edildi. Sonuç: Bu çalışmada, farklı dozlarda uygulanan LSE'nin meme fibroblast hücre hattında hücre canlılığı, hücre göçü ve bu etkilerden olası sorumlu gen ekspresyonları üzerinde önemli etkileri olduğu bulundu.
Anahtar Kelimeler: Sülük salgı ekstraktı; hücre canlılığı; anjiyogenez; apopitoz; proliferasyon
REFERANSLAR:
- Ayhan H, Mollahaliloğlu S. Tıbbi sülük tedavisi: hirudoterapi [Medicinal leech therapy: hirudotherapy]. Ankara Medical Journal. 2018;18(1):141-8. [Crossref]
- Baskova IP, Kostrjukova ES, Vlasova MA, Kharitonova OV, Levitskiy SA, Zavalova LL, et al. Proteins and peptides of the salivary gland secretion of medicinal leeches Hirudo verbana, H. medicinalis, and H. orientalis. Biochemistry (Mosc). 2008;73(3):315-20. [Crossref] [PubMed]
- Alam SS, Ahmad W, Yunus SS. Irsal-e-Alaq (leech therapy/hirudo therapy) in surgical diseases: a review. IJMR. 2016;1(4):23-7. [Link]
- Abdullah S, Dar LM, Rashid A, Tewari A. Hirudotherapy/leech therapy: applications and indications in surgery. Arch Clin Exp Surg. 2012;1(3):172-80. [Link]
- Itrat M, Zarnigar HN, Hague N. Historical aspects of leech therapy: a critical review. Int J Health Sci Res. 2013;3(7):78-83. [Link]
- Parlakpınar H, Polat S. Hirudoterapi (tıbbi sülük uygulaması) tarihçesi. Parlakpınar H, editör. Hirudoterapi (Tıbbi Sülük Uygulaması). 1. Baskı. Ankara: Türkiye Klinikleri; 2021. p.1-6.
- Hildebrandt JP, Lemke S. Small bite, large impact-saliva and salivary molecules in the medicinal leech, Hirudo medicinalis. Naturwissenschaften. 2011;98(12):995-1008. [Crossref] [PubMed]
- Shankar KM, Rao SD, Umar SN, Gopalakrishnaiah V. A clinical trial for evaluation of leech application in the management of Vicarcikā (Eczema). Anc Sci Life. 2014;33(4):236-41. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- Bakhshi M, Jalalian B, Valian M, Shariati S, Saeidi T, Ranjbar H. Can leech therapy be used as an alternative treatment for controlling migraine headache? A pilot study. Acta Facultatis Medicae Naissensis. 2015;32(3):189-97. [Crossref]
- Rai PK, Singh AK, Singh OP, Rai NP, Dwivedi AK. Efficacy of leech therapy in the management of osteoarthritis (Sandhivata). Ayu. 2011;32(2):213-7. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- Weinfeld AB, Yuksel E, Boutros S, Gura DH, Akyurek M, Friedman JD. Clinical and scientific considerations in leech therapy for the management of acute venous congestion: an updated review. Ann Plast Surg. 2000;45(2):207-12. [Crossref] [PubMed]
- Ünal K, Erol M, Ayhan H. Literature Review on the Effectiveness of Medicinal Leech Therapy in the Wound Healing. Ankara Medical Journal. 2023; 23(1):151-64. [Crossref]
- Öner Küçük M, Yaman O. Tıbbi sülük terapisi (hirudoterapi) [Medical leech therapy (hirudotherapy)]. Journal of Biotechnology and Strategic Health Research. 2019;3(Özel sayı):29-46. [Crossref]
- Gödekmerdan A, Arusan S, Bayar B, Sağlam N. Tıbbi sülükler ve hirudoterapi [Medicinal leeches and hirudotherapy]. Turkiye Parazitol Derg. 2011;35(4):234-9. [Crossref] [PubMed]
- Glyova O. Modern Hirudotherapy-A Review. Biotherapeutics, Education and Research Foundation: The BeTER LeTTER. 2005;2(1):3. [Link]
- Ünal K, Erol ME. Tıbbi sülük salgisinin biyokimyasi. Karaman O, editör. Sağlık & Bilim 2022: Medikal Araştırmalar IV. 1. Baskı. İstanbul: Efeakademi Yayınları; 2022. p.215-28.
- Resmî Gazete (27.10.2014, Sayı: 29158) sayılı Geleneksel ve Tamamlayıcı Tıp Uygulamaları Yönetmeliği; 2014. (Erişim tarihi: 08/07/2023). Erişim linki: [Link]
- Baskova IP, Zavalova LL, Basanova AV, Sass AV. Separation of monomerizing and lysozyme activities of destabilase from medicinal leech salivary gland secretion. Biochemistry (Mosc). 2001;66(12):1368-73. [Crossref] [PubMed]
- Abdualkader AM, Merzouk A, Ghawi AM, Alaama M. Some biological activities of Malaysian leech saliva extract. IIUM Engineering Journal. 2011;12(4):1-9. [Crossref]
- Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-75. [Crossref] [PubMed]
- Grada A, Otero-Vinas M, Prieto-Castrillo F, Obagi Z, Falanga V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 2017;137(2):e11-e16. [Crossref] [PubMed]
- Shakouri A, Kahroba H, Hamishekar H, Abdolalizadeh J. Nanoencapsulation of Hirudo medicinalis proteins in liposomes as a nanocarrier for inhibiting angiogenesis through targeting VEGFA in the Breast cancer cell line (MCF-7). Bioimpacts. 2022;12(2):115-26. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- Wang CH, Pandey S, Sivalingam K, Shibu MA, Kuo WW, Yu-LanYeh, et al. Leech extract: a candidate cardioprotective against hypertension-induced cardiac hypertrophy and fibrosis. J Ethnopharmacol. 2021;264:113346. [Crossref] [PubMed]
- Xu L, Li X, Zhang E, Liang H, Li W, Wang S, et al. The effect of leech extracts on endothelial cell coagulation-related factors and endothelial dysfuction-related molecules. Clin Exp Hypertens. 2019;41(3):220-30. [Crossref] [PubMed]
- Merzouk A, Ghawi A, Abdualkader A, Abdullahi A, Alaama M. Anticancer effects of medical Malaysian leech saliva extract (LSE). Pharm Anal Acta S. 2012;15:1-5. [Crossref]
- Pang X, Zhang Y, Peng Z, Shi X, Han J, Xing Y. Hirudin reduces nephropathy microangiopathy in STZ-induced diabetes rats by inhibiting endothelial cell migration and angiogenesis. Life Sci. 2020;255:117779. [Crossref] [PubMed]
- Ünal K, Erol ME. Tıbbi sülük tedavisinin bilimsel değeri [The scientific value of the medicinal leech therapy]. Anadolu Tıbbı Dergisi. 2023;1(3):33-42. [Link]
- Yingxin G, Guoqian Y, Jiaquan L, Han X. Effects of natural and recombinant hirudin on VEGF expression and random skin flap survival in a venous congested rat model. Int Surg. 2013;98(1):82-7. [Crossref] [PubMed] [PMC]
.: İşlem Listesi