.: ORİJİNAL ARAŞTIRMA
Method Description for Obtaining Primary Fibroblast Cultures from Human Tenon's Capsule
İnsan Tenon Kapsülünden Primer Fibroblast Kültürlerinin Üretilmesinde Yöntem Tanımlanması
Turkiye Klinikleri J Ophthalmol. 2009;18(2):108-12
Makale Dili: EN
Tam Metin
ABSTRACT
Objective: Human tenon's capsule derived fibroblasts have been widely used in order to constitute in vitro models, especially for studies regarding ophthalmic surgery. Though they are quite difficult to culture primarily, no actual method in detail could be found in literature. In this study, we have aimed to propose an effective procedure including biopsy localizations, reagents and culture conditions. Material and Methods: Explants of human tenon's capsule were obtained from 7 patients at the time of pars plana vitrectomy (PPV) surgery. From PPV incision areas 5 tenon's capsule and 2 tenon's capsule + conjunctiva specimens were harvested from 3 and 2 patients respectively, whereas 2 juxtalimbal tenon's capsule specimens were harvested from other 2 patients. The cross-sections were prepared from paraffin blocks for histological analysis. Tenon's tissues were put into dulbecco's minimal essential medium and then placed into a 6 well culture plate containing dulbecco's minimal essential medium +10-20% fetal calf serum. Cells were incubated in a 5% CO2 humidified incubator. Results: From the tenon's capsule samples taken from pars plana vetrectomy incision areas, fibroblasts were detected neither culture nor histological paraffin blocks. Production of confluent fibroblasts was achieved in materials taken from the juxtalimbal area and from tenon's capsule + conjunctiva tissue specimens. It was seen easly when proliferated fibroblasts anchored to plates pre-covered gelatin and serum. Detachment of the confluent cells was obtained via 0.5% trypsin exposure. Conclusions: In this study, we have succeeded to produce adequate cells and also standardized ur method of primary fibroblast cultures derived from human tenon's capsule, including tissue biopsy, transport and culture. On the other hand, findings like better production of fibroblasts in juxtalimbal area, may yield the necessity of further studies.
Keywords: Glaucoma; cell culture techniques; methods; fibroblasts
Objective: Human tenon's capsule derived fibroblasts have been widely used in order to constitute in vitro models, especially for studies regarding ophthalmic surgery. Though they are quite difficult to culture primarily, no actual method in detail could be found in literature. In this study, we have aimed to propose an effective procedure including biopsy localizations, reagents and culture conditions. Material and Methods: Explants of human tenon's capsule were obtained from 7 patients at the time of pars plana vitrectomy (PPV) surgery. From PPV incision areas 5 tenon's capsule and 2 tenon's capsule + conjunctiva specimens were harvested from 3 and 2 patients respectively, whereas 2 juxtalimbal tenon's capsule specimens were harvested from other 2 patients. The cross-sections were prepared from paraffin blocks for histological analysis. Tenon's tissues were put into dulbecco's minimal essential medium and then placed into a 6 well culture plate containing dulbecco's minimal essential medium +10-20% fetal calf serum. Cells were incubated in a 5% CO2 humidified incubator. Results: From the tenon's capsule samples taken from pars plana vetrectomy incision areas, fibroblasts were detected neither culture nor histological paraffin blocks. Production of confluent fibroblasts was achieved in materials taken from the juxtalimbal area and from tenon's capsule + conjunctiva tissue specimens. It was seen easly when proliferated fibroblasts anchored to plates pre-covered gelatin and serum. Detachment of the confluent cells was obtained via 0.5% trypsin exposure. Conclusions: In this study, we have succeeded to produce adequate cells and also standardized ur method of primary fibroblast cultures derived from human tenon's capsule, including tissue biopsy, transport and culture. On the other hand, findings like better production of fibroblasts in juxtalimbal area, may yield the necessity of further studies.
Keywords: Glaucoma; cell culture techniques; methods; fibroblasts
ÖZET
Amaç: Hasta tenon kapsül biyopsilerinden alınan fibroblastlar, başta glokom cerrahisinde antifibrotik ajan kullanımı olmak üzere in vitro modeller oluşturmakta sıkça kullanılmaktadır. Bu hücrelerden primer kültür eldesi zor olmakla birlikte, güncel literatür detaylı bir metot bilgisinden yoksundur. Bu çalışmada alınacak dokuların lokalizasyonu ve kültür koşullarının standardize edilmesi planlandı. Gereç ve Yöntemler: PPV uygulanan 7 hastadan, sırasıyla 3 ve 2 hastadan 5 tenon kapsülü ve 2 tenon + konjonktiva doku parçacıkları ile diğer 2 hastadan jukstalimbal bölgeden alınan 2 tenon kapsülü "dulbecco's minimal essential medium" besiyerlerinde, farklı oranlarda FCS ve farklı yapışma faktörleri ile kültür yapıldı. Histolojik analiz için yatay kesitler hazırlandı. "dulbecco's minimal essential medium" + 10-20% FCS içeren multiwellere alınarak %5 CO2 içeren nemli inkübatöre konuldu. Bulgular: Pars plana vetrectomy insizyon bölgelerinden alınan tenon doku örneklerinde, histolojik preparatlarda ve kültürlerde fibroblast gözlenmedi. Aynı bölgelerden alınan tenon + konjonktiva dokularında ise 2-3 gün sonra yoğun metafazda fibroblastlar gözlendi. Jukstalimbal bölgeden alınan 2 materyalde ise ("dulbecco's minimal essential medium" + %15 `fetal calf serum`) yine yoğun fibroblast üretimi başarıldı. Önceden serum ve jelatin kaplanmış "plate"lerde prolifere olan fibroblastlar tabana yapışık olarak kolaylıkla gözlendi. Hücreler %5 tripsin kullanılarak kaldırıldı. Sonuç: Bu çalışmada, ihtiyaç duyduğumuz hücrelerin eldesinin yanı sıra, doku alımı, transportu ve primer kültür metodolojisinde bir standardizasyon sağlanabilmiştir. Diğer taraftan, fibroblastların jukstalimbal bölgeden üretiminin daha başarılı olması gibi bazı bulgularla ilgili daha ileri araştırmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Glokom; hücre kültürü teknikleri; metotlar; fibroblastlar
Amaç: Hasta tenon kapsül biyopsilerinden alınan fibroblastlar, başta glokom cerrahisinde antifibrotik ajan kullanımı olmak üzere in vitro modeller oluşturmakta sıkça kullanılmaktadır. Bu hücrelerden primer kültür eldesi zor olmakla birlikte, güncel literatür detaylı bir metot bilgisinden yoksundur. Bu çalışmada alınacak dokuların lokalizasyonu ve kültür koşullarının standardize edilmesi planlandı. Gereç ve Yöntemler: PPV uygulanan 7 hastadan, sırasıyla 3 ve 2 hastadan 5 tenon kapsülü ve 2 tenon + konjonktiva doku parçacıkları ile diğer 2 hastadan jukstalimbal bölgeden alınan 2 tenon kapsülü "dulbecco's minimal essential medium" besiyerlerinde, farklı oranlarda FCS ve farklı yapışma faktörleri ile kültür yapıldı. Histolojik analiz için yatay kesitler hazırlandı. "dulbecco's minimal essential medium" + 10-20% FCS içeren multiwellere alınarak %5 CO2 içeren nemli inkübatöre konuldu. Bulgular: Pars plana vetrectomy insizyon bölgelerinden alınan tenon doku örneklerinde, histolojik preparatlarda ve kültürlerde fibroblast gözlenmedi. Aynı bölgelerden alınan tenon + konjonktiva dokularında ise 2-3 gün sonra yoğun metafazda fibroblastlar gözlendi. Jukstalimbal bölgeden alınan 2 materyalde ise ("dulbecco's minimal essential medium" + %15 `fetal calf serum`) yine yoğun fibroblast üretimi başarıldı. Önceden serum ve jelatin kaplanmış "plate"lerde prolifere olan fibroblastlar tabana yapışık olarak kolaylıkla gözlendi. Hücreler %5 tripsin kullanılarak kaldırıldı. Sonuç: Bu çalışmada, ihtiyaç duyduğumuz hücrelerin eldesinin yanı sıra, doku alımı, transportu ve primer kültür metodolojisinde bir standardizasyon sağlanabilmiştir. Diğer taraftan, fibroblastların jukstalimbal bölgeden üretiminin daha başarılı olması gibi bazı bulgularla ilgili daha ileri araştırmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Glokom; hücre kültürü teknikleri; metotlar; fibroblastlar
.: İşlem Listesi