İnorganik pirofosfataz osteoblastlarda tip I kollajen yapımını indükler
İnorganik pirofosfataz osteoblastlarda tip I kollajen yapımını indükler
Makale Dili: TR
ÖZET
Giriş: Kemik dokusunda fizyolojik kalsifikasyon seçiciliği, fibriller kollajen I ve kalsifikasyon inhibitör pirofosfatı (PPi) hidrolize ederek fosfat (P) oluşturan dokuya spesifik olmayan alkalen fosfataz (TNAP) osteoblastlarının ortak ekspresyonunu yansıtır. PPi-oluşturan ekto-enzim NPP1 eksikliği olan insanlar ve farelerde hücre dışı matriks genişlemesinin olduğu alanlarda yumuşak doku kalsifikasyonu görülür. İlginç olarak, nötral pH optimumda PPi hidrolizi yoluyla Pi oluşturan sitozolik inorganik pirofosfatazın (iPPiaz) osteoblastlardaki fonksiyonu bilinmemektedir. Ennp1−/− ve doğal tip (DT) farelerin osteoblastlarında iPPiaz'ı inceledik ve iPPiaz'ın kollajen I ekspresyonunu düzenlediği hipotezini değerlendirdik. Metot: Kalsifikasyon oluşturmak için fare kalvaryal osteoblastları askorbat ve ß-gliserol ile işleme tabi tutarak sitozolik Pi ve PPi düzeylerini, sodyuma bağlı Pi alımını, Pit-1 Pi ko-transporter ekspresyonunu ve iPPiaz ve TNAP aktivite ve ekspresyonunu değerlendirdik. Ayrıca osteoblastlardaki transfekte olan Ppa1 fonksiyonunu da değerlendirdik. Bulgular: İn situ Enpp1−/− kalvaryumda TNAP değil, inorganik pirofosfataz yüksekti. Primer Enpp1−/− kalvaryal osteoblast kültüründe DT osteoblastlarda gözlenen fizyolojik TNAP regülasyondan çok, düz TNAP aktivitesine rağmen kalsifikasyon artmış bulundu. Artmış iPPiaz, sodyuma bağlı Pi alımının ve Pit-1 ekspresyonunun artması ve belirgin derecede artmış kollajen I sentezine bağlı olarak Enpp1−/− osteoblastlar, DT osteoblastlarla benzer düzeyde sitozolik Pi düzeyi sağladılar. Enpp1−/− osteoblastlarda 3,4-dehidroprolin kullanarak kollajen sentezinin bastırılması kalsifikasyonu belirgin şekilde baskıladı. Son olarak, DT osteoblastlarda Ppa1 transfeksiyonu sitozolik Pi'i arttırdı, hücre dışı PPi'ı değil ama sitozolik PPi'i azalttı ve hem kollajen I sentezini hem de kalsifikasyonu uyardı. Sonuçlar: iPPiaz'ın artması "Pi aç" ve NPP1-eksik osteoblastlar tarafından kalsifikasyonun artmasına bağlıdır. Ayrıca iPPiaz, mRNA ekspresyon ve sentez düzeylerinde kollajen I'i indükler ve TNAP aksine, hidroksiapatit kristal inhibitörü PPi'nin hücre dışı konsantrasyonunda azalmaya yol açmadan osteoblastlar tarafından kalsifikasyonu uyarır.
Anahtar Kelimeler: PPi; Pi Dokuya spesifik olmayan Alkalen Fosfataz; Kalsifikasyon; Enpp1
Giriş: Kemik dokusunda fizyolojik kalsifikasyon seçiciliği, fibriller kollajen I ve kalsifikasyon inhibitör pirofosfatı (PPi) hidrolize ederek fosfat (P) oluşturan dokuya spesifik olmayan alkalen fosfataz (TNAP) osteoblastlarının ortak ekspresyonunu yansıtır. PPi-oluşturan ekto-enzim NPP1 eksikliği olan insanlar ve farelerde hücre dışı matriks genişlemesinin olduğu alanlarda yumuşak doku kalsifikasyonu görülür. İlginç olarak, nötral pH optimumda PPi hidrolizi yoluyla Pi oluşturan sitozolik inorganik pirofosfatazın (iPPiaz) osteoblastlardaki fonksiyonu bilinmemektedir. Ennp1−/− ve doğal tip (DT) farelerin osteoblastlarında iPPiaz'ı inceledik ve iPPiaz'ın kollajen I ekspresyonunu düzenlediği hipotezini değerlendirdik. Metot: Kalsifikasyon oluşturmak için fare kalvaryal osteoblastları askorbat ve ß-gliserol ile işleme tabi tutarak sitozolik Pi ve PPi düzeylerini, sodyuma bağlı Pi alımını, Pit-1 Pi ko-transporter ekspresyonunu ve iPPiaz ve TNAP aktivite ve ekspresyonunu değerlendirdik. Ayrıca osteoblastlardaki transfekte olan Ppa1 fonksiyonunu da değerlendirdik. Bulgular: İn situ Enpp1−/− kalvaryumda TNAP değil, inorganik pirofosfataz yüksekti. Primer Enpp1−/− kalvaryal osteoblast kültüründe DT osteoblastlarda gözlenen fizyolojik TNAP regülasyondan çok, düz TNAP aktivitesine rağmen kalsifikasyon artmış bulundu. Artmış iPPiaz, sodyuma bağlı Pi alımının ve Pit-1 ekspresyonunun artması ve belirgin derecede artmış kollajen I sentezine bağlı olarak Enpp1−/− osteoblastlar, DT osteoblastlarla benzer düzeyde sitozolik Pi düzeyi sağladılar. Enpp1−/− osteoblastlarda 3,4-dehidroprolin kullanarak kollajen sentezinin bastırılması kalsifikasyonu belirgin şekilde baskıladı. Son olarak, DT osteoblastlarda Ppa1 transfeksiyonu sitozolik Pi'i arttırdı, hücre dışı PPi'ı değil ama sitozolik PPi'i azalttı ve hem kollajen I sentezini hem de kalsifikasyonu uyardı. Sonuçlar: iPPiaz'ın artması "Pi aç" ve NPP1-eksik osteoblastlar tarafından kalsifikasyonun artmasına bağlıdır. Ayrıca iPPiaz, mRNA ekspresyon ve sentez düzeylerinde kollajen I'i indükler ve TNAP aksine, hidroksiapatit kristal inhibitörü PPi'nin hücre dışı konsantrasyonunda azalmaya yol açmadan osteoblastlar tarafından kalsifikasyonu uyarır.
Anahtar Kelimeler: PPi; Pi Dokuya spesifik olmayan Alkalen Fosfataz; Kalsifikasyon; Enpp1
ABSTRACT
Introduction: The physiologic selectivity of calcification in bone tissue reflects selective co-expression by osteoblasts of fibrillar collagen I and of tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), which hydrolyzes the calcification inhibitor pyrophosphate (PPi) and generates phosphate (Pi). Humans and mice deficient in the PPi-generating ecto-enzyme NPP1 demonstrate soft tissue calcification, occurring at sites of extracellular matrix expansion. Significantly, the function in osteoblasts of cytosolic inorganic pyrophosphatase (abbreviated iPPiase), which generates Pi via PPi hydrolysis with neutral pH optimum, remains unknown. We assessed iPPiase in Enpp1−/− and wild type (WT) mouse osteoblasts and we tested the hypothesis that iPPiase regulates collagen I expression. Methods: We treated mouse calvarial osteoblasts with ascorbate and ?-glycerol phosphate to promote calcification, and we assessed cytosolic Pi and PPi levels, sodium-dependent Pi uptake, Pit-1 Pi co-transporter expression, and iPPiase and TNAP activity and expression. We also assessed the function of transfected Ppa1 in osteoblasts. Results: Inorganic pyrophosphatase but not TNAP was elevated in Enpp1−/− calvariae in situ. Cultured primary Enpp1−/− calvarial osteoblasts demonstrated increased calcification despite flat TNAP activity rather than physiologic TNAP up-regulation seen in WT osteoblasts. Despite decreased cytosolic PPi in early culture, Enpp1−/− osteoblasts maintained cytosolic Pi levels comparable to WT osteoblasts, in association with increased iPPiase, enhanced sodium-dependent Pi uptake and expression of Pit-1, and markedly increased collagen I synthesis. Suppression of collagen synthesis in Enpp1−/− osteoblasts using 3,4-dehydroproline markedly suppressed calcification. Last, transfection of Ppa1 in WT osteoblasts increased cytosolic Pi and decreased cytosolic but not extracellular PPi, and induced both collagen I synthesis and calcification. Conclusions: Increased iPPiase is associated with "Pi hunger" and increased calcification by NPP1-deficient osteoblasts. Furthermore, iPPiase induces collagen I at the levels of mRNA expression and synthesis and, unlike TNAP, stimulates calcification by osteoblasts without reducing the extracellular concentration of the hydroxyapatite crystal inhibitor PPi.
Keywords: PPi; Pi; Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase; Calcification; Enpp1
Introduction: The physiologic selectivity of calcification in bone tissue reflects selective co-expression by osteoblasts of fibrillar collagen I and of tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), which hydrolyzes the calcification inhibitor pyrophosphate (PPi) and generates phosphate (Pi). Humans and mice deficient in the PPi-generating ecto-enzyme NPP1 demonstrate soft tissue calcification, occurring at sites of extracellular matrix expansion. Significantly, the function in osteoblasts of cytosolic inorganic pyrophosphatase (abbreviated iPPiase), which generates Pi via PPi hydrolysis with neutral pH optimum, remains unknown. We assessed iPPiase in Enpp1−/− and wild type (WT) mouse osteoblasts and we tested the hypothesis that iPPiase regulates collagen I expression. Methods: We treated mouse calvarial osteoblasts with ascorbate and ?-glycerol phosphate to promote calcification, and we assessed cytosolic Pi and PPi levels, sodium-dependent Pi uptake, Pit-1 Pi co-transporter expression, and iPPiase and TNAP activity and expression. We also assessed the function of transfected Ppa1 in osteoblasts. Results: Inorganic pyrophosphatase but not TNAP was elevated in Enpp1−/− calvariae in situ. Cultured primary Enpp1−/− calvarial osteoblasts demonstrated increased calcification despite flat TNAP activity rather than physiologic TNAP up-regulation seen in WT osteoblasts. Despite decreased cytosolic PPi in early culture, Enpp1−/− osteoblasts maintained cytosolic Pi levels comparable to WT osteoblasts, in association with increased iPPiase, enhanced sodium-dependent Pi uptake and expression of Pit-1, and markedly increased collagen I synthesis. Suppression of collagen synthesis in Enpp1−/− osteoblasts using 3,4-dehydroproline markedly suppressed calcification. Last, transfection of Ppa1 in WT osteoblasts increased cytosolic Pi and decreased cytosolic but not extracellular PPi, and induced both collagen I synthesis and calcification. Conclusions: Increased iPPiase is associated with "Pi hunger" and increased calcification by NPP1-deficient osteoblasts. Furthermore, iPPiase induces collagen I at the levels of mRNA expression and synthesis and, unlike TNAP, stimulates calcification by osteoblasts without reducing the extracellular concentration of the hydroxyapatite crystal inhibitor PPi.
Keywords: PPi; Pi; Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase; Calcification; Enpp1
.: İşlem Listesi