.: ORİJİNAL ARAŞTIRMA
Degrade Adli Örnekler için Mitokondriyal DNA Amplifikasyon ve Dizileme Stratejisi Geliştirme: Deneysel Çalışma
Developing a Mitochondrial DNA Amplification and Sequencing Strategy for Degraded Forensic Samples: Experimental Research
Turkiye Klinikleri J Foren Sci Leg Med. 2025;22(2):98-108
doi: 10.5336/forensic.2024-106910
Makale Dili: TR
Tam Metin
ÖZET
Amaç: İnsanlarda mitokondriyal DNA (mtDNA) analizi, yüksek stabilitesi ve hücre başına çok sayıda genom kopyası içermesi nedeniyle yüksek oranda bozunmuş iskelet kalıntılarının adli amaçlı kimliklendirilmesinde güçlü bir araç olmuştur. Bu çalışmada, ileri derecede bozunmuş iskelet kalıntılarında kısa mtDNA parçaların çoğaltılması ve dizi analizi amacıyla midi ve mini multipleks polimeraz zincir reaksiyonu [polymerase chain reaction (PCR)] setleri tasarlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Tasarlanan midi ve mini multipleks PCR setlerinin etkinliğini araştırmak amacıyla toprak altında kalma süreleri 3-68 yıl arasında değişen ve yaşları 22-93 arasında olan toplam 14 kişiye ait diş veya femur kemiğine ait DNA örnekleri kullanılmıştır. Silika temelli DNA ekstraksiyon yöntemi ile 1 gr kemik tozundan izole edilen DNA örneklerinde çeşitli uzunluklarda amplikon üretilebilecek 2 ayrı multipleks PCR seti hazırlanmıştır. Multipleks PCR için seçilen primer setlerinden biri mtDNA'nın ortalama 250 bp uzunluğunda fragmanların amplifikasyonuna izin veren 2 multipleks reaksiyondan oluşan midi primer seti; diğeri ise daha ileri seviyede degrade örneklerde kullanılabilecek olan 100-150 bp uzunlukta fragmanların amplifikasyonuna olanak tanıyan mini primer setidir ki, o da 3 multipleks reaksiyondan oluşmaktadır. Bulgular: Mini primer seti ile 68 yıla kadar iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınırken, midipleks set ile 45 yıla kadar olan iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınmıştır. Sonuç: Multipleks setler ile analiz için kullanılan genomik DNA miktarı azaldığından örnek kaybı en aza inmektedir. Ayrıca kullanılan malzeme ve iş gücü dikkate alındığında, multipleks setlerle hem iş gücü hem de maliyet önemli ölçüde azalmaktadır. Bu primer setleri, başta iskelet kalıntıları olmak üzere ileri derecede bozunmuş DNA örneklerinde kullanılabilecektir.
Anahtar Kelimeler: Degrade mitokondriyal DNA; dizi analizi; adli kimliklendirme; kemik; multipleks PCR
Amaç: İnsanlarda mitokondriyal DNA (mtDNA) analizi, yüksek stabilitesi ve hücre başına çok sayıda genom kopyası içermesi nedeniyle yüksek oranda bozunmuş iskelet kalıntılarının adli amaçlı kimliklendirilmesinde güçlü bir araç olmuştur. Bu çalışmada, ileri derecede bozunmuş iskelet kalıntılarında kısa mtDNA parçaların çoğaltılması ve dizi analizi amacıyla midi ve mini multipleks polimeraz zincir reaksiyonu [polymerase chain reaction (PCR)] setleri tasarlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Tasarlanan midi ve mini multipleks PCR setlerinin etkinliğini araştırmak amacıyla toprak altında kalma süreleri 3-68 yıl arasında değişen ve yaşları 22-93 arasında olan toplam 14 kişiye ait diş veya femur kemiğine ait DNA örnekleri kullanılmıştır. Silika temelli DNA ekstraksiyon yöntemi ile 1 gr kemik tozundan izole edilen DNA örneklerinde çeşitli uzunluklarda amplikon üretilebilecek 2 ayrı multipleks PCR seti hazırlanmıştır. Multipleks PCR için seçilen primer setlerinden biri mtDNA'nın ortalama 250 bp uzunluğunda fragmanların amplifikasyonuna izin veren 2 multipleks reaksiyondan oluşan midi primer seti; diğeri ise daha ileri seviyede degrade örneklerde kullanılabilecek olan 100-150 bp uzunlukta fragmanların amplifikasyonuna olanak tanıyan mini primer setidir ki, o da 3 multipleks reaksiyondan oluşmaktadır. Bulgular: Mini primer seti ile 68 yıla kadar iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınırken, midipleks set ile 45 yıla kadar olan iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınmıştır. Sonuç: Multipleks setler ile analiz için kullanılan genomik DNA miktarı azaldığından örnek kaybı en aza inmektedir. Ayrıca kullanılan malzeme ve iş gücü dikkate alındığında, multipleks setlerle hem iş gücü hem de maliyet önemli ölçüde azalmaktadır. Bu primer setleri, başta iskelet kalıntıları olmak üzere ileri derecede bozunmuş DNA örneklerinde kullanılabilecektir.
Anahtar Kelimeler: Degrade mitokondriyal DNA; dizi analizi; adli kimliklendirme; kemik; multipleks PCR
ABSTRACT
Objective: The analysis of mitochondrial DNA (mtDNA) in humans has been a powerful tool in the identification of highly decomposed skeletal remains for forensic identification due to its high stability and the large number of genome copies per cell. In this study, multiplex polymerase chain reaction (PCR) sets were designed with midi and mini primers for amplification and sequence analysis of very short mtDNA fragments to perform sequence analysis of the mtDNA control region in highly degraded skeletal remains. Material and Methods: In order to investigate the effectiveness of the designed midi and mini multiplex PCR sets, DNA samples of teeth or femur bones belonging to a total of 14 people aged between 22-93 and whose duration of underground residence varied between 3-68 years, were used. Two separate multiplex PCR sets were prepared to produce amplicons of various lengthsin DNA samples isolated from 1 g of bone powder by silica-based DNA extraction method. One of the primer sets selected for multiplex PCR is the midi primer set consisting of 2 multiplex reactions, which allows the amplification of mtDNA fragments with an average length of 250 bp; The other one is a mini primer set that allows the amplification of 100-150 bp long fragments that can be used in more advanced degraded samples, and it consists of 3 multiplex reactions. Results: While successful results were obtained on skeletal remains up to 68 years old with the mini primer set, successful results were obtained on skeletal remains up to 45 years old with the midiplex set. Conclusion: With multiplex sets, sample loss is minimized as the amount of genomic DNA used for analysis is reduced. In addition, considering the material and labour used, both labour and cost are significantly reduced with multiplex sets. These primer sets can be used in highly degraded DNA samples, especially skeletal remains.
Keywords: Degraded mitochondrial DNA; sequence analysis; forensic identification; bone; multiplex PCR
Objective: The analysis of mitochondrial DNA (mtDNA) in humans has been a powerful tool in the identification of highly decomposed skeletal remains for forensic identification due to its high stability and the large number of genome copies per cell. In this study, multiplex polymerase chain reaction (PCR) sets were designed with midi and mini primers for amplification and sequence analysis of very short mtDNA fragments to perform sequence analysis of the mtDNA control region in highly degraded skeletal remains. Material and Methods: In order to investigate the effectiveness of the designed midi and mini multiplex PCR sets, DNA samples of teeth or femur bones belonging to a total of 14 people aged between 22-93 and whose duration of underground residence varied between 3-68 years, were used. Two separate multiplex PCR sets were prepared to produce amplicons of various lengthsin DNA samples isolated from 1 g of bone powder by silica-based DNA extraction method. One of the primer sets selected for multiplex PCR is the midi primer set consisting of 2 multiplex reactions, which allows the amplification of mtDNA fragments with an average length of 250 bp; The other one is a mini primer set that allows the amplification of 100-150 bp long fragments that can be used in more advanced degraded samples, and it consists of 3 multiplex reactions. Results: While successful results were obtained on skeletal remains up to 68 years old with the mini primer set, successful results were obtained on skeletal remains up to 45 years old with the midiplex set. Conclusion: With multiplex sets, sample loss is minimized as the amount of genomic DNA used for analysis is reduced. In addition, considering the material and labour used, both labour and cost are significantly reduced with multiplex sets. These primer sets can be used in highly degraded DNA samples, especially skeletal remains.
Keywords: Degraded mitochondrial DNA; sequence analysis; forensic identification; bone; multiplex PCR
REFERANSLAR:
- Wilson MR, Stoneking M, HoIland MM, DiZinno JA, Budowle B. Guidelines for the use of mitochondrial DNA sequencing in forensic science. Crime Lab Digest 1993;20:68-77. [Link]
- Sullivan KM, Hopgood R, Gill P. Identification of human remains by amplification and automated sequencing of mitochondrial DNA. Int J Legal Med. 1992;105(2):83-6. [Crossref] [PubMed]
- Berger C, Parson W. Mini-midi-mito: adapting the amplification and sequencing strategy of mtDNA to the degradation state of crime scene samples. Forensic Sci Int Genet. 2009;3(3):149-53. [Crossref] [PubMed]
- Gabriel MN, Huffine EF, Ryan JH, Los CW, Yang NCS, Holland MM, et al. Improved strategies for mtDNA sequence analysis of highly degraded forensic remains. 2000. [Link]
- Amorim A, Fernandes T, Taveira N. Mitochondrial DNA in human identification: a review. PeerJ. 2019;7:e7314. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- Budowle B, Allard MW, Wilson MR, Chakraborty R. Forensics and mitochondrial DNA: applications, debates, and foundations. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2003;4:119-41. [Crossref] [PubMed]
- Guo X, Wang Y, Zhang R, Gu Z. STAMP: a multiplex sequencing method for simultaneous evaluation of mitochondrial DNA heteroplasmies and content. NAR Genom Bioinform. 2020;2(4):lqaa065. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- Carracedo A, Bär W, Lincoln P, Mayr W, Morling N, Olaisen B, et al. DNA commission of the international society for forensic genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing. Forensic Sci Int. 2000;110(2):79-85. [Crossref] [PubMed]
- Kim NY, Lee HY, Park SJ, Yang WI, Shin KJ. Modified midi- and mini-multiplex PCR systems for mitochondrial DNA control region sequence analysis in degraded samples. J Forensic Sci. 2013;58(3):738-43. [PubMed]
- Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nature Genetics 1999;23(2):147-7. [Crossref]
- Levin BC, Cheng H, Reeder DJ. A human mitochondrial DNA standard reference material for quality control in forensic identification, medical diagnosis, and mutation detection. Genomics. 1999;55(2):135-46. [Crossref] [PubMed]
- Serin A, Canan H, Alper B, Korkut Gulmen M, Zimmermann B, Parson W. Mitochondrial DNA control region haplotype and haplogroup diversity in South Eastern Turkey. Forensic Sci Int Genet. 2016;24:176-9. [Crossref] [PubMed]
- Eichmann C, Parson W. 'Mitominis': multiplex PCR analysis of reduced size amplicons for compound sequence analysis of the entire mtDNA control region in highly degraded samples. Int J Legal Med. 2008;122(5):385-8. [PubMed]
- ThermoFisher. Precision ID mtDNA panels with the HID ion S5?/HID ion GeneStudio? S5 system application guide. 2021. [Link]
- Obal M, Zupanc T, Zupanič Pajnič I. Measure quantity of mitochondrial DNA in aged bones or calculate it from nuclear DNA quantitative PCR results? Int J Legal Med. 2023;137(6):1653-9. [Crossref] [PubMed] [PMC]
- King TE, Fortes GG, Balaresque P, Thomas MG, Balding D, Maisano Delser P, et al. Identification of the remains of King Richard III. Nat Commun. 2014;5:5631. [Crossref] [PubMed] [PMC]
.: İşlem Listesi